2024年5月22日，浙江大學生命科學研究院/動物科學學院朱永群課題組、生命科學學院周艷課題組和北京大學劉小云課題組聯合在Nature上發表了題為“Legionella effector LnaB is a phosphoryl-AMPylase that impairs phosphosignalling”的文章，發現了一類廣泛存在于病原菌中新型的LnaB家族磷�；鶈瘟姿嵯佘账峄感鞍�，揭示了全新的磷�；佘账峄揎椇驼{節磷酸化信號轉導的方式，突破了磷酸化是終端化的、在細胞內不可被進一步共價修飾的傳統概念。該工作還闡釋了病原菌通過同一效應蛋白既保護宿主經典泛素通路，又抑制宿主免疫防御反應，以達到與宿主細胞短期共存的目的，實現了“綿里藏針”的致病策略。
單磷酸腺苷酸化修飾（AMPylation）是一種最早發現于1967年、廣泛存在于原核生物和真核生物中的蛋白質翻譯后修飾，在內質網應激、神經退行性疾病、適應性免疫等過程中發揮著重要作用。以往的研究發現，該修飾主要由Fic等家族單磷酸腺苷酸化酶（AMPylase）催化，將單磷酸腺苷酸（AMP）基團轉移到靶蛋白上，之前鑒定出的單磷酸腺苷酸化修飾位點均發生在蛋白底物的蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸等殘基上。
嗜肺軍團菌是導致人類軍團病的致病菌，其感染肺巨噬細胞，在宿主細胞內形成獨特的膜泡結構，從而生存和繁殖。2016年羅招慶、Ivan Dikic、Ralph Isberg和茅毓新等多個實驗室先后發現，嗜肺軍團菌利用SidE家族效應蛋白催化不依賴E1和E2的非典型泛素化過程，通過對泛素（Ub）第42位精氨酸殘基進行ADP-核糖基化修飾（ADPRR42 -Ub）的中間步驟，最終將泛素以磷酸核糖基（P-ribose）共價連接到相關底物蛋白質的絲氨酸殘基上，促進嗜肺軍團菌膜泡的成熟，該非典型泛素化過程及其隨后的效應蛋白DupA/B的作用，產生了磷酸核糖化泛素分子（PRR42-Ub）。 磷酸核糖化泛素分子（PRR42-Ub）對宿主具有細胞毒性，說明可能需要特殊的效應蛋白消除這些毒性泛素分子、或者對泛素進行其他修飾，才能有利于該菌在宿主細胞內生存、達到與宿主細胞短期的共存。
為了驗證嗜肺軍團菌是否存在特殊的效應蛋白消除PRR42-Ub、或者對泛素進行其他修飾，該研究建立了獨特體外和體內篩選體系，發現其效應蛋白LnaB是一個獨特的AMPylase（腺苷酸化酶），以ATP作為配體，以宿主肌動蛋白（actin）作為激活劑，對PRR42-Ub的磷酰基催化單磷酸腺苷酸化（AMPylation）修飾，從而生成ADPRR42-Ub。生成的ADPRR42-Ub進一步由效應蛋白MavL水解成為Ub。這個由LnaB和MavL催化形成的級聯反應，實現了對非經典泛素化過程的逆轉（圖2），從而保護了對嗜肺軍團菌胞內生存和宿主細胞正常生理過程都至關重要的經典泛素化通路。
圖2. LnaB和MavL催化形成的級聯反應，實現了對非經典泛素化過程的逆轉
該研究進一步發現LnaB能夠抑制酵母生長，由于PRR42-Ub是由SidE家族效應蛋白產生，不是酵母本身存在的蛋白，說明LnaB在細胞內可能存在其他底物。不僅如此，過表達LnaB實驗在293T細胞產生了大量的單磷酸腺苷酸化修飾信號。由于LnaB作用于PRR42-Ub的磷酸核糖基的磷酰基，而磷酰基廣泛存在于所有磷酸化蛋白上，說明LnaB可能修飾磷酸化蛋白。
隨后實驗發現，過表達持續激活形式的酪氨酸激酶NPM-ALK或者加入磷酸酶抑制劑岡田酸處理后，都會顯著增加LnaB催化AMPylation的水平。利用質譜技術，發現LnaB能夠對含有磷酸化絲氨酸、磷酸化蘇氨酸和磷酸化酪氨酸殘基的多肽類底物，進行磷�；鶈瘟姿嵯佘账峄�，進而產生特殊的ADPylation修飾（圖3）。
圖3. LnaB對磷酸化多肽催化腺苷酸化并產生ADPylation修飾
該研究發現在感染過程中，LnaB對宿主細胞內至關重要的Src家族激酶的活化環（activation loop）上保守磷酸化酪氨酸殘基進行磷酰基單磷酸腺苷酸化。修飾后的Src家族激酶喪失了活性，抑制了下游磷酸化信號轉導，從而抑制了其介導免疫信號通路。LnaB也是迄今為止唯一鑒定出的可以直接修飾Src家族激酶活化環上磷酸化酪氨酸殘基的細菌毒力因子。
該研究隨后通過同源搜索，鑒定出了162個LnaB同源蛋白，它們廣泛分布于20多個不同菌屬中，構成一類新型的磷�；鶈瘟姿嵯佘栈讣易�。該家族成員具有兩個保守的獨特SG和H-E催化基序，與先前發現Fic家族的結構不同，具有新型的折疊模式。結構研究顯示，肌動蛋白結合到LnaB的C端，穩定其催化結構域中的β發夾結構，保證配體ATP的結合，從而激活LnaB的酶學活性。該家族的161個成員具有三型、四型或者六型分泌系統的分泌信號肽，表明它們可能作用于相應的靶細胞，有1個成員沒有分泌信號肽，其可能作用于細菌自身。
該項研究有以下幾點重要發現和概念突破：
1. 發現了一類不同于以往的、具有獨特催化基序和結構特征的磷�；鶈瘟姿嵯佘账峄福≒hosphoryl-AMPylase）新家族；
2. 發現了靶向磷�；南佘账峄ˋMPylation）修飾，突破了AMPylation只發生在蛋白質氨基酸殘基上的概念；
3. 發現了調節磷酸化信號轉導的全新方式，突破了磷酸化是終端化的、在細胞內不可被進一步共價修飾的傳統概念；
4. 定義了一種新型的蛋白質翻譯后修飾，即ADPylation修飾；
5. 揭示了病原菌利用同一效應蛋白既保護宿主泛素通路，又抑制宿主免疫防御，達到與宿主短期共存目的，實現“綿里藏針”的致病策略（圖4）；
6. LnaB家族的發現揭示了一種病原菌保守的調節宿主信號通路的機制，為病原菌致病性和效應蛋白的研究提供新思路。
2024年5月22日，浙江大學生命科學研究院/動物科學學院朱永群課題組、生命科學學院周艷課題組和北京大學劉小云課題組聯合在Nature上發表了題為“Legionella effector LnaB is a phosphoryl-AMPylase that impairs phosphosignalling”的文章，發現了一類廣泛存在于病原菌中新型的LnaB家族磷�；鶈瘟姿嵯佘账峄感鞍�，揭示了全新的磷�；佘账峄揎椇驼{節磷酸化信號轉導的方式，突破了磷酸化是終端化的、在細胞內不可被進一步共價修飾的傳統概念。該工作還闡釋了病原菌通過同一效應蛋白既保護宿主經典泛素通路，又抑制宿主免疫防御反應，以達到與宿主細胞短期共存的目的，實現了“綿里藏針”的致病策略。
單磷酸腺苷酸化修飾（AMPylation）是一種最早發現于1967年、廣泛存在于原核生物和真核生物中的蛋白質翻譯后修飾，在內質網應激、神經退行性疾病、適應性免疫等過程中發揮著重要作用。以往的研究發現，該修飾主要由Fic等家族單磷酸腺苷酸化酶（AMPylase）催化，將單磷酸腺苷酸（AMP）基團轉移到靶蛋白上，之前鑒定出的單磷酸腺苷酸化修飾位點均發生在蛋白底物的蘇氨酸、酪氨酸、絲氨酸等殘基上。
嗜肺軍團菌是導致人類軍團病的致病菌，其感染肺巨噬細胞，在宿主細胞內形成獨特的膜泡結構，從而生存和繁殖。2016年羅招慶、Ivan Dikic、Ralph Isberg和茅毓新等多個實驗室先后發現，嗜肺軍團菌利用SidE家族效應蛋白催化不依賴E1和E2的非典型泛素化過程，通過對泛素（Ub）第42位精氨酸殘基進行ADP-核糖基化修飾（ADPRR42 -Ub）的中間步驟，最終將泛素以磷酸核糖基（P-ribose）共價連接到相關底物蛋白質的絲氨酸殘基上，促進嗜肺軍團菌膜泡的成熟，該非典型泛素化過程及其隨后的效應蛋白DupA/B的作用，產生了磷酸核糖化泛素分子（PRR42-Ub）。 磷酸核糖化泛素分子（PRR42-Ub）對宿主具有細胞毒性，說明可能需要特殊的效應蛋白消除這些毒性泛素分子、或者對泛素進行其他修飾，才能有利于該菌在宿主細胞內生存、達到與宿主細胞短期的共存。
為了驗證嗜肺軍團菌是否存在特殊的效應蛋白消除PRR42-Ub、或者對泛素進行其他修飾，該研究建立了獨特體外和體內篩選體系，發現其效應蛋白LnaB是一個獨特的AMPylase（腺苷酸化酶），以ATP作為配體，以宿主肌動蛋白（actin）作為激活劑，對PRR42-Ub的磷�；呋瘑瘟姿嵯佘账峄ˋMPylation）修飾，從而生成ADPRR42-Ub。生成的ADPRR42-Ub進一步由效應蛋白MavL水解成為Ub。這個由LnaB和MavL催化形成的級聯反應，實現了對非經典泛素化過程的逆轉（圖2），從而保護了對嗜肺軍團菌胞內生存和宿主細胞正常生理過程都至關重要的經典泛素化通路。
圖2. LnaB和MavL催化形成的級聯反應，實現了對非經典泛素化過程的逆轉
該研究進一步發現LnaB能夠抑制酵母生長，由于PRR42-Ub是由SidE家族效應蛋白產生，不是酵母本身存在的蛋白，說明LnaB在細胞內可能存在其他底物。不僅如此，過表達LnaB實驗在293T細胞產生了大量的單磷酸腺苷酸化修飾信號。由于LnaB作用于PRR42-Ub的磷酸核糖基的磷�；�，而磷酰基廣泛存在于所有磷酸化蛋白上，說明LnaB可能修飾磷酸化蛋白。
隨后實驗發現，過表達持續激活形式的酪氨酸激酶NPM-ALK或者加入磷酸酶抑制劑岡田酸處理后，都會顯著增加LnaB催化AMPylation的水平。利用質譜技術，發現LnaB能夠對含有磷酸化絲氨酸、磷酸化蘇氨酸和磷酸化酪氨酸殘基的多肽類底物，進行磷酰基單磷酸腺苷酸化，進而產生特殊的ADPylation修飾（圖3）。
圖3. LnaB對磷酸化多肽催化腺苷酸化并產生ADPylation修飾
該研究發現在感染過程中，LnaB對宿主細胞內至關重要的Src家族激酶的活化環（activation loop）上保守磷酸化酪氨酸殘基進行磷酰基單磷酸腺苷酸化。修飾后的Src家族激酶喪失了活性，抑制了下游磷酸化信號轉導，從而抑制了其介導免疫信號通路。LnaB也是迄今為止唯一鑒定出的可以直接修飾Src家族激酶活化環上磷酸化酪氨酸殘基的細菌毒力因子。
該研究隨后通過同源搜索，鑒定出了162個LnaB同源蛋白，它們廣泛分布于20多個不同菌屬中，構成一類新型的磷�；鶈瘟姿嵯佘栈讣易�。該家族成員具有兩個保守的獨特SG和H-E催化基序，與先前發現Fic家族的結構不同，具有新型的折疊模式。結構研究顯示，肌動蛋白結合到LnaB的C端，穩定其催化結構域中的β發夾結構，保證配體ATP的結合，從而激活LnaB的酶學活性。該家族的161個成員具有三型、四型或者六型分泌系統的分泌信號肽，表明它們可能作用于相應的靶細胞，有1個成員沒有分泌信號肽，其可能作用于細菌自身。
該項研究有以下幾點重要發現和概念突破：
1. 發現了一類不同于以往的、具有獨特催化基序和結構特征的磷�；鶈瘟姿嵯佘账峄福≒hosphoryl-AMPylase）新家族；
2. 發現了靶向磷�；南佘账峄ˋMPylation）修飾，突破了AMPylation只發生在蛋白質氨基酸殘基上的概念；
3. 發現了調節磷酸化信號轉導的全新方式，突破了磷酸化是終端化的、在細胞內不可被進一步共價修飾的傳統概念；
4. 定義了一種新型的蛋白質翻譯后修飾，即ADPylation修飾；
5. 揭示了病原菌利用同一效應蛋白既保護宿主泛素通路，又抑制宿主免疫防御，達到與宿主短期共存目的，實現“綿里藏針”的致病策略（圖4）；
6. LnaB家族的發現揭示了一種病原菌保守的調節宿主信號通路的機制，為病原菌致病性和效應蛋白的研究提供新思路。
這項研究鑒定出的ADPylation修飾，擴展人們對蛋白質翻譯后修飾的認識，證明了磷酸化蛋白磷酰基團修飾的可行性，為蛋白質功能和信號轉導提供新的調控機制。由于Src家族激酶在人類多種疾病中發揮重要作用，對LnaB的獨特活性進行開發，對相關疾病治療具有潛在的應用價值。進一步研究LnaB家族效應蛋白的功能，將開辟病原菌效應蛋白研究的新方向。
博士生王婷、碩士生宋曉楠和博士后譚加興為本文的共同第一作者，朱永群教授、周艷研究員和劉小云研究員為本文共同通訊作者，參與研究的還有博士生冼偉、周星彤、虞銘汝、王小飛、徐艷、吳婷、苑軻軻、冉宇和楊兵教授、范高峰教授。其中劉小云研究員、冼偉和周星彤分別在質譜分析和結構方面做了重要貢獻，范高峰教授在磷酸化多肽和磷酸化信號轉導方面提供了熱情幫助。該研究的順利實施還要感謝清華大學江鵬、浙江大學余奕、馮新華、徐平龍、南京醫科大學季晨博、中山大學陸勇軍和普渡大學羅招慶等教授們的大力支持。該研究獲得了國家基金委、科技部重點研發專項、中組部青年拔尖人才等資助。
